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液相色譜柱使用太難？這些Tips搞定它！

來(lái)源：實(shí)驗(yàn)與分析時(shí)間：2020-07-28 20:09:01 瀏覽：4523次

色譜柱安裝、啟用和維護(hù)

1、柱頭類型和不銹鋼毛細(xì)管接頭的匹配

色譜柱是消耗品，不是儀器原配的情況很多。如果接頭和柱頭深度不匹配將會(huì)產(chǎn)生漏液或者死體積過(guò)大的現(xiàn)象。接頭比柱頭深度長(zhǎng)，不易擰緊而漏液；接頭比柱頭深度短，柱頭內(nèi)留有空隙而產(chǎn)生死體積，使譜帶展寬和峰拖尾。

2、溶劑的匹配轉(zhuǎn)換

色譜柱內(nèi)保存溶劑和儀器系統(tǒng)內(nèi)存留溶劑，如果和流動(dòng)相不匹配，使用前需進(jìn)行轉(zhuǎn)換。特別是流動(dòng)相含緩沖鹽時(shí)，如保存溶劑是純有機(jī)相或有機(jī)相比例高，直接將新柱接入使用，會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽在柱內(nèi)結(jié)晶析出，最嚴(yán)重會(huì)將新柱永久不可逆地?fù)p壞。正相柱保存溶劑一般為正己烷，如果要轉(zhuǎn)換成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，轉(zhuǎn)換中間需用二氯甲烷或乙酸乙酯過(guò)渡。

3、新柱使用前的平衡和老化

廠家出廠檢驗(yàn)時(shí)一般都已進(jìn)行過(guò)平衡，但色譜柱到最終用戶時(shí)間不一，用戶正式測(cè)定前最好對(duì)色譜柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起進(jìn)行的方法是運(yùn)行幾次完整的分析程序（包括進(jìn)樣），直到觀察到峰形、保留時(shí)間和峰面積穩(wěn)定為止。所謂“老化”是借用了氣相的術(shù)語(yǔ)，目的是達(dá)到分析物在色譜柱以及整個(gè)液相系統(tǒng)流路中的吸附飽和。對(duì)某些特定的待測(cè)物，如分子量大于1000的，因擴(kuò)散速度慢，老化時(shí)間相應(yīng)要長(zhǎng)，可采取大濃度進(jìn)樣或在同一個(gè)洗脫周期內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣多針的方式加快老化。

4、pH使用范圍

一般認(rèn)為硅膠基質(zhì)柱子的pH使用范圍是2-8，這是很粗略的。硅膠類型、使用溫度、硅膠表面所鍵合的固定相類型以及緩沖鹽的不同，對(duì)此均有影響。硅膠比孔容小、鍵合密度大的填料pH耐受范圍要大一些，有些選用高品質(zhì)硅膠，加上高密度鍵合和雙封尾，或特殊工藝使pH耐受范圍最大提高到10。磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng)，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會(huì)降低pH使用范圍。有機(jī)雜化硅膠以及硅膠表面涂覆雜化層的硅膠填料，有機(jī)質(zhì)的存在使pH使用范圍能到12以上。拿到柱子第一時(shí)間閱讀說(shuō)明書(shū)，確認(rèn)色譜柱內(nèi)的封存液，有條件可以依照COA報(bào)告做柱效測(cè)試。

5、色譜柱保存

短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流動(dòng)相（不含緩沖鹽）保存為佳，以盡量減少下次使用的平衡時(shí)間。一般只建議在長(zhǎng)期保存反相柱的時(shí)候用純甲醇或乙腈，一方面純有機(jī)相保存有最大限度減少鍵合相水解的作用，但純甲醇（乙腈）又會(huì)將已水解而暫時(shí)吸附在柱內(nèi)的鍵合相洗脫出去，使固定相流失進(jìn)程加快，壽命縮短。純有機(jī)相保存還有易揮發(fā)使柱床變干的缺點(diǎn)，使用80%左右有機(jī)相保存也屬好的選擇，且足以避免長(zhǎng)菌。強(qiáng)烈建議在柱身上貼標(biāo)簽標(biāo)明保存溶劑。

CN基柱在有機(jī)極性溶劑中柱床不穩(wěn)定（會(huì)導(dǎo)致柱床結(jié)構(gòu)坍塌），適合在水相中低溫保存。低溫保存要確保不發(fā)生固定相凍結(jié)而損壞柱床。離子交換柱和水性SEC柱等適合保存在水溶液中的色譜柱，可加0.05%疊氮化鈉溶液防止長(zhǎng)菌。

正相柱，無(wú)論是短期還是長(zhǎng)期，都推薦保存在所用流動(dòng)相中。

色譜柱柱壓

柱壓反映了色譜柱的內(nèi)部狀況，所以是 HPLC方法中的最重要參數(shù)之一，當(dāng)柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時(shí)進(jìn)行維護(hù)和補(bǔ)救，嚴(yán)重時(shí)色譜柱就已報(bào)廢了。下面是色譜柱柱壓方程。

對(duì)填充色譜柱，柱壓與黏度 (η)、柱長(zhǎng) (L)和流速 (F)成正比，與填料粒徑（d p）以及柱管半徑（r）的平方成反比。K0是比滲透性系數(shù)，對(duì)填充床，其值約為0.001。通過(guò)此公式可近似計(jì)算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當(dāng)新柱實(shí)際測(cè)得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說(shuō)柱壓存在問(wèn)題。

黏度 (η)取決于流動(dòng)相溶劑的選擇，為降低柱壓，反相色譜中傾向于選擇低黏度的乙腈，而不是高黏度的異丙醇。當(dāng)然選擇時(shí)還需考慮溶劑強(qiáng)度、極性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。柱長(zhǎng)（L）增加可以提高分離度（R），流速（F）提高能加快分離，但都會(huì)導(dǎo)致柱壓上升，選擇確定這些運(yùn)行參數(shù)時(shí)，需綜合平衡和折中。

填料粒徑對(duì)柱壓影響極大，d p降低一倍，柱壓將增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 μm填料，柱壓超過(guò)普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱溫因可降低黏度η，相應(yīng)降低柱壓。在梯度洗脫時(shí)，黏度隨流動(dòng)相組成的變化而改變，柱壓也會(huì)處在不斷變化中。對(duì)水/甲醇流動(dòng)相體系，在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。

內(nèi)徑的影響同樣很大，根據(jù)線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內(nèi)徑的色譜柱流速為1ml/min，約相當(dāng)于在2.1mm內(nèi)徑色譜柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5ml/min，計(jì)算公式為v＝1.0ml/min x（內(nèi)徑r/4.6）2。所以在換不同內(nèi)徑色譜柱時(shí)，請(qǐng)及時(shí)調(diào)整流速，以免因高柱壓損傷色譜系統(tǒng)。

柱壓下降是儀器系統(tǒng)的連接有泄漏，柱壓不穩(wěn)定一般認(rèn)為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱相關(guān)的柱壓?jiǎn)栴}是柱壓上升。

柱壓波動(dòng)的原因及解決辦法

和柱壓波動(dòng)相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板（inlet frit）以及其后面1-2cm長(zhǎng)度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：

1、填料破碎和使用后有填料粉末生成

填料破碎一般在裝柱過(guò)程中發(fā)生，裝柱壓力過(guò)大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過(guò)低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決；流動(dòng)相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板，不過(guò)打開(kāi)承壓的后篩板，對(duì)柱床會(huì)有不好影響。

2、顆粒物堵塞引起柱壓上升和對(duì)策

可能堵塞進(jìn)口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來(lái)源有：樣品（制樣時(shí)灰塵和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動(dòng)相（溶劑本身含有和配制過(guò)程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）。

水和緩沖鹽流動(dòng)相內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌，也是顆粒物來(lái)源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應(yīng)避免將這類流動(dòng)相在室溫下久放，可放入冰箱存放。

（1）預(yù)防措施

樣品（甚至標(biāo)準(zhǔn)品）和流動(dòng)相過(guò)濾，既預(yù)防了篩板、柱頭和毛細(xì)管堵塞，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關(guān)鍵部件的磨損。普通用0.45um孔徑濾膜過(guò)濾樣品和流動(dòng)相，對(duì)使用2um以下填料的超高壓柱的，可用0.20um濾膜。濾膜材質(zhì)有再生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須根據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性慎重選擇。

使用保護(hù)柱或在線過(guò)濾器，具體安裝位置見(jiàn)下圖：

在線過(guò)濾器內(nèi)裝有可更換的濾片，濾片孔徑一般有2um和0.5um兩種。安裝位置有兩個(gè)可選擇，在進(jìn)樣器和色譜柱之間時(shí)，對(duì)樣品和流動(dòng)相中的顆粒物都有效；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對(duì)流動(dòng)相有過(guò)濾作用。

保護(hù)柱是縮小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可更換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于防止色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過(guò)濾顆粒物的作用。

（2）故障排除

反沖色譜柱：不連接檢測(cè)器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開(kāi)始時(shí)反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步提高沖洗壓力。有時(shí)顆粒物已非常牢固嵌入到篩板內(nèi)部，反沖不一定湊效，早反沖、勤反沖相對(duì)效果更好。有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2-5um）的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。

換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會(huì)帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導(dǎo)致柱效下降。不過(guò)如果反沖不能解決問(wèn)題，也只能不得已而為之，要不然就要把色譜柱報(bào)廢了。

如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說(shuō)明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進(jìn)樣器、在線過(guò)濾器和保護(hù)柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵。

3、化學(xué)污染物引起柱壓上升和對(duì)策

來(lái)源同樣是樣品、流動(dòng)相和系統(tǒng)，不過(guò)來(lái)源于樣品的污染最普遍，特別是對(duì)復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時(shí)候?；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來(lái)源的物質(zhì)。

像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會(huì)在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測(cè)器一般對(duì)此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為干擾峰、基線波動(dòng)、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰。

保留能力中等的污染物，會(huì)被慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動(dòng)和基線緩慢漂移。

對(duì)強(qiáng)保留的污染物，一般流動(dòng)相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會(huì)逐步在柱頭累積。有時(shí)，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對(duì)分析物起作用，引起保留時(shí)間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到一定程度，如果不采取措施，會(huì)堵塞填料間隙，引起柱壓上升。最好的辦法是選用合適的溶劑沖洗溶解這些物質(zhì)，同時(shí)又不對(duì)填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。

（1）預(yù)防措施：

a．制樣時(shí)采用SPE固相萃取等方法，預(yù)先將色譜柱殺手類的污染物質(zhì)清除掉；

b．連接保護(hù)柱。保護(hù)柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上應(yīng)于分析柱一致，才能最大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個(gè)設(shè)計(jì)和裝填良好的保護(hù)柱，還可增加分析柱的分離效率。如果因某種原因需在保護(hù)柱中用不同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保留能力弱的固定相，這時(shí)的保護(hù)柱完全用于截住強(qiáng)保留物質(zhì)，類似于SPE小柱的功效。當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用盡時(shí)，也不能說(shuō)不可再清洗后復(fù)用，但價(jià)格低不值得去花這個(gè)時(shí)間。

c．經(jīng)常對(duì)分析柱進(jìn)行沖洗維護(hù)。

（2）故障排除：

已經(jīng)累積很多污染物，用甲醇或乙腈簡(jiǎn)單沖洗不奏效，推薦使用下面方法清洗反相柱100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷用每種溶劑沖洗至少10個(gè)柱體積，對(duì)于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過(guò)渡，然后回到原來(lái)的流動(dòng)相體系。

對(duì)受蛋白類污染的硅膠基質(zhì)反相柱，純有機(jī)溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì)。由有機(jī)溶劑、緩沖液和酸,有時(shí)還加上離子對(duì)試劑等組成的配方清洗效果極佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液對(duì)柱子重復(fù)進(jìn)行梯度洗來(lái)再生；Bhadwaj和Day試驗(yàn)了在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇，再生效果良好。

清洗硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯沖洗。對(duì)油脂類物質(zhì)，可用異丙醇清洗。

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實(shí)驗(yàn)與分析

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