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精選干貨丨光學(xué)表面等離子共振儀SPR技術(shù)應(yīng)用合集來了

來源：測(cè)試GO 時(shí)間：2023-02-16 14:06:58 瀏覽：6782次

發(fā)展歷史

表面等離子共振技術(shù)（Surface Plasmon Resonance，SPR）起源于上世紀(jì)初，是一種新型光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。它能簡(jiǎn)單快捷的監(jiān)測(cè)DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、藥物與蛋白質(zhì)之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間、受體與配體之間等等生物分子之間的相互作用，因而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

1902年，Wood等人在一次光學(xué)實(shí)驗(yàn)中，首次發(fā)現(xiàn)了SPR現(xiàn)象并對(duì)其做了簡(jiǎn)單的記錄，但直到39年后的1941年，一位名叫Fano的科學(xué)家才真正解釋了SPR現(xiàn)象。

之后的30年間，SPR技術(shù)并沒有實(shí)質(zhì)的發(fā)展，也沒能投入到實(shí)際應(yīng)用中去。1971年Kretschmann等人為SPR傳感器結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)，也拉開了應(yīng)用SPR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的序幕。

1983年，Liedberg等人首次將SPR用于抗原抗體的反應(yīng)測(cè)定并取得了成功。

1987年，Knoll等人開始研究基于SPR技術(shù)的成像設(shè)施。

1990年，Pharmacia Biosensor AB公司（現(xiàn)為Cytiva公司）開發(fā)出了首臺(tái)商品化SPR儀器，為SPR技術(shù)更加廣泛的應(yīng)用開啟了新的樂章。自此，隨著科技的日新月異，SPR技術(shù)逐漸完善，其檢測(cè)系統(tǒng)也愈發(fā)成熟。

基本結(jié)構(gòu)及原理

SPR的核心部件包括光學(xué)系統(tǒng)、傳感器芯片、液體處理系統(tǒng)三個(gè)主要部分，其他的組成部分包括LED狀態(tài)指示器及溫度控制系統(tǒng)等。其中：

光學(xué)系統(tǒng)的核心是能夠產(chǎn)生和測(cè)量SPR信號(hào)的光電組分，該組分又被稱為光學(xué)檢測(cè)單元；

傳感器的芯片是SPR最為核心的部件。在SPR技術(shù)中必須有一個(gè)生物分子偶聯(lián)在傳感片上，然后用它去捕獲可與之進(jìn)行特異反應(yīng)的生物分子。傳感芯片又分為三個(gè)主要組成部分，分別是光波導(dǎo)耦合器件、金屬膜以及分子敏感膜。

液體處理系統(tǒng)包括兩個(gè)液體傳送泵，其中一個(gè)泵負(fù)責(zé)保持穩(wěn)定流速的液體流過傳感芯片表面，另一個(gè)泵負(fù)責(zé)自動(dòng)進(jìn)樣裝置中的樣品傳送。

通常，當(dāng)入射的p-偏振光以特定的角度在棱鏡內(nèi)傳播到金屬膜表面發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，光無法穿過兩種介質(zhì)的臨界面，但會(huì)沿著臨界面平行的方向產(chǎn)生光波，即消逝波。在發(fā)生全反射現(xiàn)象的同時(shí)，入射光會(huì)與金屬薄膜表面的等離子體（價(jià)電子）相互作用引起電子系統(tǒng)的集體震蕩。因庫侖力的存在使得這種現(xiàn)象反復(fù)進(jìn)行，進(jìn)而形成等離子振蕩，以波的形式表現(xiàn)即等離子波。當(dāng)消逝波和等離子波的方向和頻率相同時(shí)，就產(chǎn)生了SPR現(xiàn)象。

發(fā)生SPR現(xiàn)象時(shí)，金屬自由電子通過共振吸收光能量，導(dǎo)致反射光強(qiáng)度明顯降低，此時(shí)光的入射角被稱為共振角。研究發(fā)現(xiàn)，SPR現(xiàn)象的共振角的大小與金屬膜電介質(zhì)的折射率密切相關(guān)。在利用SPR技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)物時(shí)，需要將能與待測(cè)物結(jié)合的生物靶分子鍵合在金屬膜表面。當(dāng)含有目標(biāo)物的溶液經(jīng)過傳感器的金屬膜表面時(shí)，發(fā)生目標(biāo)物和生物靶分子的特異性結(jié)合反應(yīng)，由此引發(fā)了金屬膜表面折射率的變化，同時(shí)光路系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到的SPR共振角也發(fā)生變化，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物定量的目的（圖1）。

圖1 SPR的構(gòu)造及原理示意圖

應(yīng)用案例解析

與傳統(tǒng)檢測(cè)分子相互作用方法相比，SPR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、靈敏度高、可以無標(biāo)記地實(shí)時(shí)測(cè)量動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)。因此，SPR應(yīng)用逐漸趨向多樣化，在各種生物檢測(cè)（蛋白質(zhì)、病毒分子等）、傳感器甚至儲(chǔ)能催化領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用。下面，筆者就列舉SPR近期的部分最新熱點(diǎn)成果，帶領(lǐng)大家一窺“廬山真面目”！

實(shí)例1 檢測(cè)蛋白-小分子間的相互作用

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c04986

在蛋白質(zhì)中，芳香族氨基酸的殘基通過各種π相互作用在調(diào)節(jié)蛋白-配體結(jié)合過程中起到關(guān)鍵作用，例如π-π，cation-π，和CH-π等。雖然π相互作用很早就成為蛋白質(zhì)功能研究的一個(gè)熱點(diǎn)，但是π作用機(jī)制以及作用力大小尚不清楚。其中的一個(gè)主要原因在于試驗(yàn)技術(shù)方法有限，無法監(jiān)測(cè)由于蛋白微環(huán)境改變從而導(dǎo)致的π作用力變化。

有鑒于此，荷蘭格羅寧根大學(xué)Broos等人通過氨基酸衍生物策略對(duì)芳香環(huán)π電子云強(qiáng)度進(jìn)行微改變，從而來研究并定量分析蛋白質(zhì)中的π作用力。作者首先確定以LmrR蛋白作為模型來研究π-π相互作用機(jī)制及作用力大小，并選取了一系列含有氟原子取代基的色氨酸衍生物來替換LmrR蛋白中的W96位置（圖2）。質(zhì)譜分析確定超過95%的W96被替換成相應(yīng)的色氨酸衍生物。

采用SPR技術(shù)，作者發(fā)現(xiàn)隨著色氨酸衍生物中氟原子取代基數(shù)量增加，衍生物標(biāo)記的LmrR蛋白與芳香小分子之間的親和力（K_d）逐漸降低。其中LmrR蛋白與Riboflavin（RBF）的親和力降低了近70倍，表明該親和力很大程度上取決于色氨酸芳香環(huán)上π電子云強(qiáng)度（圖3）。

最后，作者采用同樣手段檢測(cè)了膜蛋白R(shí)ibU以排除蛋白類型可能造成的結(jié)果偏差性，結(jié)果與LmrR模型一致。該研究將為藥物設(shè)計(jì)、酶工程和蛋白設(shè)計(jì)等提供重要的理論依據(jù)。

圖2 各種色氨酸衍生物標(biāo)記的LmrR蛋白的晶體結(jié)構(gòu)

圖3 LmrR蛋白與芳香小分子之間的親和力與氟原子取代基數(shù)量的關(guān)系

實(shí)例2 檢測(cè)蛋白-蛋白間的相互作用

原文鏈接：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2021110518

全球氣候變化導(dǎo)致的異常低溫，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物（水稻）的生產(chǎn)，培育具有異常溫度耐受的品種是解決這一問題的重要途徑。農(nóng)作物的品種分子設(shè)計(jì)技術(shù)依賴于細(xì)胞感知溫度信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，細(xì)胞中溫度感受器是信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的源頭，而溫度感受器如何將溫度物理信號(hào)轉(zhuǎn)換成化學(xué)信號(hào)，其機(jī)制尚不明晰。

有鑒于此，中科院植物所種康等人根據(jù)分子遺傳學(xué)、生理生化和生物物理學(xué)等多學(xué)科融合策略，發(fā)現(xiàn)水稻細(xì)胞中鈣網(wǎng)蛋白復(fù)合物OsCRT3-OsCIPK7可以通過蛋白構(gòu)象的改變感知低溫物理信號(hào)，并使其轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的生化網(wǎng)絡(luò)信號(hào)（圖4）。SPR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示低溫下OsCRT3和OsCIPK7兩種蛋白的特異互作增強(qiáng)，表現(xiàn)為在低溫下更快的結(jié)合速率（K_a）和更慢的解離速率（K_d），結(jié)合常數(shù)K_D（K_d/K_a）減小，進(jìn)而增強(qiáng)OsCIPK7的激酶活性，從而賦予水稻更高的寒害耐受性（圖5）。該研究首次發(fā)現(xiàn)了溫度感知的新機(jī)制，即通過蛋白的構(gòu)象改變感知溫度信號(hào)，并產(chǎn)生下游的效應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)具有重要的理論意義，同時(shí)也為分子設(shè)計(jì)育種提供了新的基因模塊資源。

圖4 低溫誘導(dǎo)OsCRT3-OsCIPK7蛋白分子間相互作用改變示意圖

圖5 OsCRT3和OsCIPK7兩種蛋白分子間的相互作用

實(shí)例3 SPR用于生物傳感器

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590006422002423?via%3Dihub

基因療法能從根本上補(bǔ)充或修復(fù)缺陷基因，恢復(fù)健康基因的正常生物學(xué)功能，具有不可比擬的治療優(yōu)勢(shì)。腺病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）已經(jīng)成為預(yù)防感染、嚴(yán)重疾病和死亡的理想基因治療和疫苗載體。載體進(jìn)入體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并建立免疫記憶需要一種具有傳染性的活性病毒疫苗。然而受到病毒載體碎片干擾，精確測(cè)定病毒疫苗載體的效價(jià)濃度十分困難，進(jìn)而嚴(yán)重影響基因藥物或疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制以及精準(zhǔn)給藥。因此，迫切需要一種可準(zhǔn)確測(cè)定病毒載體的濃度和存活力的新技術(shù)。

有鑒于此，華中科技大學(xué)劉鋼、黃麗萍團(tuán)隊(duì)與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金梅林、張強(qiáng)團(tuán)隊(duì)合作，研發(fā)了一種具有納米級(jí)多功能機(jī)器人手結(jié)構(gòu)的納米等離子體（Nano RHB）生物傳感器，用于快速、無損和特異性地捕獲和定量檢測(cè)腺病毒顆粒。

采用SPR技術(shù)，作者通過聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形狀的分枝狀金納米結(jié)構(gòu)。這些分支金納米結(jié)構(gòu)的功能類似于智能機(jī)器人手，從而增強(qiáng)SPR共振效應(yīng)以提高芯片的靈敏度，同時(shí)增加表面積以提高芯片修飾效率（圖6）。將這些超靈敏生物傳感器集成到標(biāo)準(zhǔn)96孔板或32孔板中，可以直接監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)結(jié)合曲線，并使用微量樣品定量檢測(cè)腺病毒載體或疫苗。

此外，研究人員使用凍干技術(shù)將CAR蛋白標(biāo)記的金顆粒整合到單克隆抗體修飾的Nano RHB平臺(tái)上時(shí)，檢測(cè)靈敏度可以進(jìn)一步提高5倍，在5分鐘內(nèi)同時(shí)高通量檢測(cè)多達(dá)96個(gè)樣品，且檢測(cè)靈敏度提升至100 copies/mL，比傳統(tǒng)病毒滴度檢測(cè)方法更高效快捷（圖7）。

圖6 使用Nano RHB定量病毒顆粒原理示意圖

圖7 基于CAR包覆的Nano RHB平臺(tái)在5分鐘內(nèi)無標(biāo)記檢測(cè)腺病毒

實(shí)例4 SPR用于催化

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2773045X22000140?via%3Dihub

近年來，通過表面等離子體共振（SPR）來增強(qiáng)化學(xué)反應(yīng)已成為催化領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。SPR效應(yīng)是金屬納米顆粒所具備的特殊光學(xué)性質(zhì)，其可根據(jù)金屬的成分、形狀和尺寸進(jìn)行調(diào)整。這種可調(diào)諧的光-物質(zhì)相互作用為生物學(xué)、傳感和人工光合作用領(lǐng)域提供了可能性。然而，當(dāng)SPR金屬與分子相互接觸時(shí)，其SPR衰減速率會(huì)受到嚴(yán)重影響，相關(guān)機(jī)理的繁雜依然困擾著研究人員。

有鑒于此，山東大學(xué)黃柏標(biāo)、鄭昭科團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種光輔助調(diào)控Au納米棒幾何結(jié)構(gòu)的方法，合成了具有不同縱橫比的Au納米棒（Au NRs-L、Au NRs-M 和Au NRs-S），并通過單顆粒光譜技術(shù)結(jié)合宏觀實(shí)驗(yàn)和時(shí)域有限差分模擬（FDTD），實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)Au納米棒光致縮短的原位觀察以及對(duì)催化過程的原位觀測(cè)。

研究表明，在鈀（Pd）離子的輔助下，納米棒的縱向長(zhǎng)度隨光照時(shí)間逐漸縮短，而其徑向長(zhǎng)度保持不變。當(dāng)將甲酸分子注入樣品池時(shí)，觀察到Pd-Au納米棒的熒光（PL）猝滅，證實(shí)了Pd-Au納米棒和甲酸分子間的電荷轉(zhuǎn)移。最后，通過將單顆粒PL測(cè)量與FDTD、DFT計(jì)算相結(jié)合，闡明了SPR誘導(dǎo)的甲酸脫氫催化機(jī)制。這項(xiàng)工作有助于理解SPR衰減機(jī)制與納米結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，并對(duì)SPR誘導(dǎo)甲酸脫氫催化提供了指導(dǎo)。

圖8 光輔助設(shè)計(jì)策略示意圖及不同Au納米棒對(duì)應(yīng)的光譜

圖9 SPR誘導(dǎo)HCOOH脫氫的催化機(jī)理示意圖

參考文獻(xiàn)

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[2] Xiaoyu Guo, Dajian Zhang, Zhongliang Wang, Shujuan Xu, Oliver Batisti, Leonie Steinhorst, Hao Li, Yuxiang Weng, Dongtao Ren, J?rg Kudla, Yunyuan Xu, Kang Chong. Cold-induced calreticulin OsCRT3 conformational changes promote OsCIPK7 binding and temperature sensing in rice. The EMBO Journal, e110518, 2022. DOI: 10.15252/embj.2021110518.

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