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想get更多免疫檢測技術(shù)？毛細管電泳了解一下

來源：時間：2022-12-06 09:46:33 瀏覽：3645次

毛細管電泳（CE，capillary electrophoresis），又稱高效毛細管電泳（HPCE，high performance capillary electrophoresis）或毛細管電分離法（CESM，capillary electro-separation method）。毛細管電泳包容電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，以樣品的多種特性（電荷、大小、等電點、極性、親和行為、相分配特性等）為根據(jù)的分離分析技術(shù)。毛細管電泳研究正在向多種前沿領(lǐng)域推廣應(yīng)用，其中 DNA 與 RNA 分析、復雜藥物分析、環(huán)境分析、醫(yī)學(特別是代謝組學與臨床醫(yī)學)研究、蛋白質(zhì)組（多維）分離、糖組分析、手性分離、單細胞分析等工作進展很快。

1.毛細管電泳的基本理論

一、電泳

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。

1808年，Reuss（俄國）首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

1937年，Tiselius（瑞典）將電泳用于人血清蛋白質(zhì)混合液的分離：發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；這是第一次實現(xiàn)自由溶液電泳，同時他也發(fā)明了第一臺電泳儀。

1948年，Tiselius因?qū)﹄娪痉治龊臀椒椒ǖ难芯浚貏e是發(fā)現(xiàn)了血清蛋白的組分而獲得1948年諾貝爾化學獎。

二、傳統(tǒng)電泳

利用電泳現(xiàn)象對某些化學或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫做電泳法或電泳技術(shù)。傳統(tǒng)電泳具有以下分類

（1）按形狀分類：U 型管電泳、柱狀電泳、板電泳。

（2）按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳。

傳統(tǒng)電泳分析，操作繁瑣，分離效率低，定量困難，因此無法與其它分析相比。1981年，Jorgenson 和 Luckas 用 75 μm 內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/米，這促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與 GC、HPLC 相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)---毛細管電泳。

三、毛細管電泳

毛細管電泳在傳統(tǒng)電泳技術(shù)上采取了兩項重要改進：

（1）采用了25-100 μm內(nèi)徑的毛細管。標準毛細管的外徑為375 μm，有些管的外徑為160 μm。毛細管的特點是：容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL）；側(cè)面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)；在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。

（2）采用了高達數(shù)千伏的電壓。毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高；電壓升高，電場推動力大，又可以進一步使柱徑變小，柱長增加；毛細管電泳的柱效遠高于HPLC，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。

2.毛細管電泳的原理

一、基本原理

帶電離子在電場中定向移動時不同的離子具有不同的遷移速度，物質(zhì)離子在電場中的差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。

當帶電離子以速度 v 在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力（FE=qE）和平動摩擦阻力（F=fv）的作用，得到 qE = fv（q為離子所帶有效電荷，E為電場強度，v為離子在電場中的遷移速度，f為平動摩擦系數(shù)）。

對于球形離子，f=6πηγ，所以遷移速度 v=qE/6πηγ。

二、電滲透現(xiàn)象與電滲流

在電泳過程中，當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層（圖2），二者之間存在電位差。當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow，簡稱EOF）。

電滲透的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：

（1）內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向負極

（2）內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向正極

以石英毛細管柱為例，內(nèi)充液pH＞3時，表面電離成-SiO-，管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層。在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動。

改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性：表面鍵合陽離子基團。

（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑：內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，使石英毛細管壁帶正電，溶液表面帶負電。

在毛細管電泳中，電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5-7倍，因此控制電滲流非常重要。陽離子運動方向與電滲流一致，陰離子運動方向與電滲流相反，中性粒子運動方向與電滲流一致，如圖3所示。

3.毛細管電泳儀

一、工作原理

毛細管電泳儀以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和分配行為的差異而實現(xiàn)各組分分離。

二、主要構(gòu)造

毛細管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)包括一個高壓電源，一根毛細管，一個檢測器及兩個供毛細管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶，如圖5所示。

（1）高壓電源

毛細管電泳儀的高壓電源是穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；可恒壓（電壓范圍為0-30千伏）、恒流、恒功率輸出；具有電場強度程序控制系統(tǒng)；電壓穩(wěn)定性達到0.1%；能做到電源極性易轉(zhuǎn)換。

（2）毛細管柱

毛細管是CE分離的心臟，理想的毛細管必須電絕緣、紫外/可見光透明和富有彈性，目前可以使用的有塑料管、玻璃管、石英管等，其中彈性熔融石英毛細管被普遍使用。毛細管柱內(nèi)徑一般為20-75 μm，外徑350-400 μm，長度≤1m。

毛細管上具有檢測窗口，一般使用的外涂聚酰亞胺的石英毛細管由于聚酰亞胺涂層不透明，必須使用硫酸腐蝕法、灼燒法、刀片刮除法等對涂層進行剝離得到檢測窗口。

（3）緩沖液池

緩沖液池要求化學惰性，機械穩(wěn)定性好。緩沖液內(nèi)含電解質(zhì)，充填于緩沖液池和毛細管中，通過電極、導線與電源連通，是分離室中的導體。

（4）檢測器

檢測器要求具有極高的靈敏度，可柱端檢測，檢測器、數(shù)據(jù)采集和計算機數(shù)據(jù)處理一體化。CE具有多種檢測方法，比如光吸收法、電化學法、電導法、化學發(fā)光法、磷光法、熒光法、質(zhì)譜法等，其中紫外吸收已經(jīng)非常成熟，是絕大多數(shù)商品儀器的主力檢測手段，部分商品儀器采用激光誘導熒光檢測法（LIF）和高頻電導檢測法（hfCD）。紫外吸收法既能采用柱上檢測方式（圖6），也可采用柱后檢測方式（圖7）。

三、進樣方式

（1）壓力進樣：壓力進樣要求毛細管的填充介質(zhì)具有流動性，比如溶液等。將毛細管的兩端置于不同壓力環(huán)境中時，管中溶液即能流動，將樣液帶入。利用壓縮空氣可以實現(xiàn)正壓進樣，并能和毛細管清洗系統(tǒng)共享，因此商業(yè)化的儀器常采用此法。壓力進樣沒有偏向問題，但選擇性差，樣品及其背景都同時被引進管中，對后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。

（2）電動進樣：當把毛細管的進樣端插入樣品溶液中并加上電場E時，組分就會遷移進入管內(nèi)。電動進樣對毛細管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特別要求，能夠完全自動化操作，也是商品儀器必備的進樣方法。但是電動進樣對離子組分存在進樣差別，會降低分析的準確性和可靠性。

（3）擴散進樣：利用濃差擴散原理可將樣品引入毛細管。擴散進樣對管內(nèi)介質(zhì)沒有任何限制，具有雙向性，在樣品分子進入毛細管的同時，管中的背景物質(zhì)也向管外擴散，能抑制背景干擾，提高分離效率。

四、分離方式

毛細管電泳有許多不同的模式，因而在分離樣品前必須選擇合適的分離模式以達到最佳的分離結(jié)果。根據(jù)簡單性原則，首先應(yīng)該考慮自由溶液分離模式，最后才考慮填充形式的分離模式，如圖8所示。

不同的分離模式所采用的分離機理有所不同，如圖9所示。

4.毛細管電泳的應(yīng)用

毛細管電泳分析技術(shù)發(fā)展迅速，具有分離效率高、所需樣品少、應(yīng)用范圍廣、分析成本低等諸多優(yōu)點，是生物化學、分析化學、環(huán)境分析中備受關(guān)注的分離分析技術(shù)之一。

一、手性分析

在現(xiàn)代社會中，與人類健康息息相關(guān)的醫(yī)藥生產(chǎn)必須考慮手性問題，國際科學界十分重視手性藥物的分離分析，毛細管電泳是一種簡單高效的手性分析方法。

實例：柯諾辛堿B（Corynoxine B）具有降壓,抗心律失常,保護腦缺氧缺血的作用?？轮Z辛堿（Corynoxine）是柯諾辛堿B異構(gòu)體，在不同的神經(jīng)元細胞系誘導細胞自噬，結(jié)構(gòu)如圖10所示。Zhiying Wang等人[1]以環(huán)糊精（HP- β -CD）和谷氨酸（TBA-L-Glu）用作分離系統(tǒng)的添加劑，建立了一種靈敏、快速，有效的方法，用于毛細管電泳中的場放大樣品堆疊（FASS），成功分離和測定鉤藤中的柯諾辛堿和柯諾辛堿B（圖11）。

二、蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)不僅是有機體的構(gòu)建材料，也是生物功能分子，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、酶、抗體等。天然蛋白來自于基因分宜，但不一定能與基因一一對應(yīng)，翻譯后的修飾、代謝、復合或絡(luò)合等過程會使蛋白質(zhì)分子的種類復雜化，因此蛋白質(zhì)的分離分析是一個挑戰(zhàn)性的課題。毛細管電泳可用于蛋白質(zhì)分離研究中的諸多方面。

實例：Huan-Huan Zhao等人[2]結(jié)合壓力介導微分析（PMMA）和毛細管電泳的毛細管電泳方法建立了電泳介導的微量分析（EMMA），如圖12所示，并將其應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶的動力學和抑制動力學研究，以及從天然黃酮中篩選出α-葡萄糖苷酶抑制劑。

三、DNA及其碎片分析

從1988年毛細管電泳被用于DNA分析后，DNA分析中的測序、PCR產(chǎn)物鑒定、基因突變研究、DNA損傷分析、臨床診斷等都開始大量使用毛細管電泳技術(shù)。

實例：急性腹瀉在全球均有較高的發(fā)病率和死亡率，主要發(fā)生在兒童和老年人群。目前引起嬰幼兒及兒童腹瀉的最常見病毒包括輪狀病毒（rotaviruses，RV）、諾如病毒（norovirus，NoV）、腸道腺病毒（adenoviruses，Adv）、扎如病毒（sapovirus，SV）及星狀病毒（humanastroviruses，HAstV）。目前約40%的腹瀉并不能快速準確診斷出病因。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長，免疫學方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染，而且單病原體的PCR方法檢測通量較低。

蔡德豐等人[3]首次以兒童常見腹瀉病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作為診斷目標，建立多重PCR－毛細管電泳法檢測體系，以提高兒童腹瀉病毒診斷的效率。5種病毒陽性參考品擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后均檢測到相應(yīng)片段，無明顯的干擾雜峰出現(xiàn)，其他腹瀉病原體核酸對反應(yīng)體系無影響，見圖13。

四、糖及其綴合物分析

糖是自然界中廣泛存在、被人類長期利用的化學物質(zhì)。糖不僅是動植物的能源(儲能材料如糖元)和燃料，也是代謝過程的中間產(chǎn)物。在植物和微生物體中，糖是主要的結(jié)構(gòu)材料。糖也是糖綴合物的重要部件。已經(jīng)證明，糖及其綴合物在細胞識別以及其他生物分子識別中，具有不可替代的或直接的作用。糖及其綴合物的分析因此受到了越來越廣泛的重視。利用毛細管電泳分離糖首先必須解決電荷問題。除糖醒酸、唾液酸、氨基糖以及一些硫酸化糖(硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素等)外，天然糖是不帶電荷的，不能在電場中遷移。理論上，可以采用絡(luò)合、解離、衍生等方法使糖帶電。

實例：牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草Anchusa italica Retiz.或琉璃苣Borage officinales L.的地上部分，是維吾爾醫(yī)治療心腦血管疾病的常用藥材之一，具有祛寒補心、爽心悅智、潤燥消炎、止咳平喘等功效。多糖有顯著的免疫興奮、抗衰老、抗氧化活性和抗腫瘤等特性。研究牛舌草中的營養(yǎng)成分，特別是其中的糖類成分，對于深入研究其藥用價值具有重要意義。依明·尕哈甫等人[4]采用苯酚-硫酸法測定了牛舌草中多糖的含量，同時利用高效毛細管電泳法（HPLCE）測定了單糖組分(圖14），旨在為牛舌草的質(zhì)量評價和進一步研究開發(fā)該中藥資源提供有益參考。

五、毛細管電泳聯(lián)用及微流控芯片技術(shù)

常規(guī)的毛細管電泳雖然具有諸多優(yōu)點，但是也存在一些問題，比如（1）由于進樣量少，因而制備能力差；（2）由于毛細管直徑小，使光路太短，用一些檢測方法（如紫外吸收光譜法）時，靈敏度較低；（3）電滲會因樣品組成而變化，進而影響分離重現(xiàn)性。因此，毛細管電泳的聯(lián)用技術(shù)對樣品處理、分離和檢測具有重要的改進作用。

目前毛細管電泳的聯(lián)用技術(shù)主要分為分離-分離、分離-檢測、分離-鑒定、樣品處理-分離等類型，比如二維（多維）毛細管電泳、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細管電泳-核磁共振聯(lián)用、毛細管電泳-化學發(fā)光聯(lián)用、流動注射-毛細管電泳聯(lián)用等等。

此外，微流控芯片技術(shù)也是毛細管電泳的一個重要發(fā)展方向。微流控芯片技術(shù)是把化學、生物、醫(yī)學分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上, 自動完成分析全過程。芯片毛細管電泳的通道雖有各種變化，但基礎(chǔ)是十字交叉結(jié)構(gòu)，如圖15所示，將樣品置于連接進樣通道的任一電極槽中，在通道兩端加上合適的電壓，離子樣品便會遷移經(jīng)過分離通道。欲分離時，只需在垂直于進樣通道的方向上施加電壓，位于交叉口的樣品就會進入分離通道.關(guān)閉或降低進樣通道兩端的電壓，可以使進樣通道中的樣品不動或向兩邊回遷，而進入分離通道的樣品則向檢測窗口方向遷移并發(fā)生分離，經(jīng)LIF或其他檢測器檢出樣品信號。

5.參考文獻

[1] Zhiying W , Haitao G , Meng C , et al. Separation and determination of corynoxine and corynoxine B using chiral ionic liquid and hydroxypropyl-β-cyclodextrin as additives by field-amplified sample stacking in capillary electrophoresis. Electrophoresis 2018, 39, 2195–2201.

[2] Zhao H H , Liu Y , Chen J . Screening of α-glucosidase inhibitors from natural flavonoids by in-capillary assay combining PMMA and EMMA. Analytical Methods, 2019, 11, 13712019.

[3] 蔡德豐,陳運生,朱純青等. 多重PCR-毛細管電泳檢測兒童5種腹瀉病毒的方法建立及應(yīng)用. 臨床檢驗雜志, 2020, 38(01):15-18.

[4] 依明·尕哈甫,王曉梅,熱娜·卡斯木等. 牛舌草多糖的含量測定以及毛細管電泳分析. 中醫(yī)藥導報, 2019, 25(03):80-82.

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